Mikribiologi Praktikum Semester IV Universitas Bangka Belitung

PEMBUATAN MEDIA

Latar Belakang

Tujuan

1.      Mahasiswa mampu membuat media universal untuk membiakkan bakteri dan cendawan

2.      Mahasiswa mampu membedakan fungsi dari beberapa media universal

Bahan dan Alat

            Bahan yang digunakandalam praktikum ini adalah kentang, dektrosa, tepung agar, media nutrient broth, tisu, akuades, kantong plastik tahan panas, karet gelang, aluminium foil dan kertas bekas. Alat yang digunakan adalah panci, kompor, autoklaf, hot plate magnetic stir, timbangan analitik, gelas kimia 1 L, gelas ukur, dan pipet tetes.

Cara Kerja

Pembuatan media potato dextrose agar (PDA)

1.      Mengupas kentang, lalu mencucinya, menimbang sebanyak 200gr, dan mengiris tipis kentang

2.      Merebus kentang dengan 500ml akuades

3.      Menyaring ekstrak kntang, lalu memasukkan 20gr dekstrosa kedalamnya, dan melarutkan hingga homogen

4.      Setelah larutan ekstrak kentang yang dicampurkan dekstrosa dingin, dimasukkan 20gr tepung agar, dan menambahkan akuades hingga volume menjadi 1000ml

5.      Memanaskan larutan sambil diaduk hingga larut dan homogen

6.      Membagi larutan media menjadi beberapa bagian sesuai dengan ukuran botol media

Pembuatan media nutrient agar (NA)

1.      Menimbang 3gr beef extract, 5gr pepton, dan 15-20gr tepung agar

2.      Melarutkan dan memanaskan tepung agar dalam 500ml akuades sambil diaduk hingga homogen menggunakan hot plate manetic stirer

3.      Melarutkan beef extract dan pepton dalam 500ml akuades, lalu menuangkannya ke dalam larutan agar dan diaduk hingga homogen

4.      Membagi media larutan ke dalam beberapa botol media sesuai volume botol

Pembuatan media malt extract agar (MEA)

1.      Menimbang bahan seuai dengan konsentrasi yang dianjurkan pada label botol media dan 20gr tepung agar untuk membuat 1 L media MEA

2.      Menambahkan akuades 1 L, lalu memanaskannya dan diaduk hingga homogen

3.      Membagi larutan ke dalam beberapa botol media

STERILISASI ALAT DAN MEDIA

Latar Belakang

Tujuan

1.      Mahasiswa mampu memahami prinsip kerja sterilisasi pada alat

2.      Mahasiswa mampu melakukan sterilisasi pada alat dan bahan media

Bahan dan Alat

            Bahan yang digunakan adalah PDA, NA, MEA, plastik tahan panas, aluminium foil, kapas, karet gelang, kertas bekas, akuades, dan wraping plastic. Alat yang digunakan adalah erlenmeyer atau botol duran, cawan petri, tabung reaksi, batang segitiga penyebar, tip pipet mikro, mortar, botol kultur, autoklaf, dan oven.

Cara Kerja

Steriliasi Media

1.      Menutupi media yang telah dimasukkan ke dalam erlenmeyer harus ditutup dengan aluminium foil atau kapas

2.      Mensteril media menggunakan autoklaf pada suhu 121C dengan tekanan 1atm (17 Psi) selama 15 menit

3.      Mendinginkan media setelah sterilisasi selesai dan bagian tutup botol yang ditutup denga aluminium foil atau yang disumbat dengan kapas harus ditutup rapat menggunakan plastik wrap

4.      Menyimpan media pada suhu ruang atau dalm lemari pendingin

Sterilisasi Alat

1.      Membungkus alat-alat gels yang akan disteril menggunakan kertas dan plastik tahan panas

2.      Sterilisasi alat dilakukan menggunakan autoklaf pada suhu 121C dengan tekanan 1atm (17 Psi) selama 20 menit

3.      Menyimpan alat-alat yang telah disteril dalam inkubator atau oven pada suhu 50-80 C

TEKNIK ISOLASI

Tujuan

            Tujuan praktikum ini adalah mengetahui dan memahami teknik isolasi mikroorganisme (bakteri dan cendawan) dari rizoplan, rizorfer, dan endofit.

Alat dan Bahan

            Alat yang digunakan adalah cawan petri, botol kultur, segitiga batang penyebar, taabung reaksi dan rak tabung reaksi, pipet mikro dan tip, bunsen, vortex, shaker, LAF cabinet, autoklaf dan oven. Bahan yang digunakan adalah PDA, MA, dan MEA, plasstik taan panas, aluminium foil, kapas, karet gelang, kertas bekas, akuades steril, spritus, alkohol 70%, tisu steril, tisu nonsteril, dan wraping plastic.

Cara Kerja

Penyiapan Media Kultivasi

1.      Mencairkan stok media menggunkan hot plate atau kompor

2.      Mendinginkan media hingga suhu media ± 50C. Kemdian menuangkan media pada cawan petri dalam kondisi aseptik sesuai kebutuhan

3.      Mendinginkan media hingga berembun pada cawan dan menutup rapat media

Pengambilan Sampel

1.      Mengambil sampel (rhizosfer, rhizosplan, dan endofit) pada pagi hari

2.      Mengambil tanah yang berada disekitar perakaran tanaman sampel untuk sampel dari rhizosfer. Sampel diambil menggunakan cangkul dan dimasukkan ke dalam kantong plastik

3.      Mengambil tanah yang menempel pada akara tanaman sampel untuk sampel dari rhizosplan. Sampel diambil dengan cara mencabut tanaman secara perlahan dan memasukkan tanah yang melekat pada akar ke dalam kantong plastik

4.      Mengambil jaringan akar, batang, dan daun dari sampel tanaman yang sehat untuk sampel dari endofit. Sampel diambil dengan cara mencabut tanaman secara perlahan dan memasukkannya ke dalam kantong plastik.

Isolasi Mikrob Rhizosfer dan Rhizosplane

1.      Memasukkan sampel tanah (rhizosfer dan rhizosplan)ke dalam tabung erlenmeyer sebanyak 10 gram yang ditambahkan 90 ml air steril (larutan stok)

2.       Mensuspensi tanah menggunakan shaker selama 60 menit  dengan kecepatan 100 rpm

3.      Mengencekan larutan hingga

4.      Menumbuhkan 100 m dari pengenceran dan  pada media TSA serta menumbuhkan dari pengenceran  dan  pada media Martin agar dan menginkubbasinya pada suhu ruangan.

Isolasi Cendawan Endofit

1.      Menggunakan bagia akar bambu tanaman yang telihat sehat sebagai sampel

2.      Mencuci sampel dengan air mengalir, kemudian memotongnya dengan ukuran 2 hingga 3 cm, lalu dikeringkan dengan cara meletakkannya di atas tisu

3.      Mensterilisasi permukaan akan menggunakan alkohol 70% selama 1 menit, NaOCl 1% selama 1 menit, alkohol 70% 1 menit, dan kemudian membilasnya mengunakan akuades selama 1 menit sebanyak 2 kali ulangan

4.      Potongan bagian daun sampel dikeringanginkan dengan cara meletakkannya di atas tisu

5.      Memotong sampel akar dengan ukuran 5x5 mm dengan  cara mengambil bagian tengah sampel supaya jaringan yang diisolasi merupakan jaringan yang masih segar sehingga peluang isolat yang didapat lebih beragam

6.      Menempelkan satu potongan akar dari sampel sebagai kontrol untuk diamati steril atau tidaknya permukaan jaringan tersebut

7.      Menanam 5 potongan sampel pada media MEA dalam cawan petri dan menginkubasinya pada suhu ruangan. Memurnikan CE yang tumbuhndan mengamati koloni serta mengukur diameter pertumbuhannya selama 1 minggu

Isolasi Bakteri Endofit

1.      Menimbang 1 gram akar sampel dan mensterilisasi permukaannya (seperti sterilisasi endawan endofit)

2.      Setelah sampel akar dikeringanginkan, akar digerus sampai hancur menggunakan mortal steril

3.      Menambahkan 9ml air steril ke dalam esktrak daun

4.       Melakukan pengenceran berseri sampai . Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil ekstrak tanaman sebanyak 1 ml kemudian memasukkannya ke dalam 9 ml air steril

5.      Mengambil L suspensi pengenceraan  dan  menggunakan pipet mikro steril dan menyebarkannya pada media TSA 10%

6.      Menginkubasinya pada suhu ruang salama 24-48 jam. Menseleksi koloni yang tumbuh diseleksi perbedaannya secara morfologi dan dimurnikan kembali pada media TSA.

BIAKAN MURNI

Tujuan

1.      Mahasiswa mengetahui teknik peindahan atau pemurnian isolat bakteri dan cendawan hasil isolasi rhizosfer, rhizoplan, dan endofit

2.      Mahasiswa mengetahui dan memahami metode penyimpanan biakan murni bakteri dan candawan dalam jangka waktu panjang

Alat dan Bahan

            Alat yang digunakan adalah LAF cabinet, jarum ose, scapel, cock borer, lampu bunsen, dan cawan petri. Bahan yang digunakan adalah media PDA, NA, spritus, alkohol 70%, tisu, dan wraping plastic.

Cara Kerja

Cendawan

1.      Mengamati kultivasi pada media PDA setelah 3-5 hari yang ditandai koloni-koloni dengan cici-ciri morfologi berbeda

2.      Memotong koloni menggunakan cock borer dan memindahkan potongan miselium menggnakan jarum ose ke dalam media PDA yang baru

3.      Menutup rapat cawan petri menggunaakan wraping plastic dan menginkubasinya pada suhu ruangan

4.      Memotong miselium yang telah tumbuh, lalu menumbuhkannya pada media agar miring dalam tabung mikro dan menutup rapat tabung mikro kemudian disimpan dalam suhu ruangan.

Bakteri

1.      Mengamati kultivasi bakteri pada media NA setelah 24-48 jam setelah dilakukan penyebaran dan menandai koloni tunggal yang memiliki karakteristik berbeda

2.      Memindahkan koloni bakteri dengan cara menggores koloni menggunakan jarum ose pada media NA yang baru secara zig-zag

3.      Menutup rapat cawan petri menggunakan wraping plastic dan menginkubasinya selama 24-48 jam

4.      Selah murni, sel bakteri dipanen menggunakan jarum ose, kemudian memasukkannya ke dalam akuades steril dalam tabung mikro dan menghomogenkannya. Menutup tabung mikro dengan rapat

5.      Menyimpannya dalam lemari pada suhu kamar

PENGENALAN MIKROB SECARA MORFOLOGI

Tujuan

1.      Mahasiswa mengetahui karakteristik koloni bakteri secara morfologi

2.      Mahasiswa mengetahui karakteristik makroskopik dan mikroskopik cendawan secara morfologi

Alat  dan Bahan

            Alat yang digunakan yaitu cawan petri, LAF cabinet, jarum ose, scapel, lampu bunsen, kaca objek, dan kaca penutup. Bahan yang digunakan yaitu isolat bakteri yang berumur 48 jam, isolat cendawan yang berumur 1 minggu, media water agar (WA), spritus, alkohol, dan tisu.

Cara Kerja

Bakteri

1.      Mengamati karakter morfologi koloni tunggal sel bakteri yang meliputi bentuk, ukuran, tepian, elevasi, permukaan, transpirasi dan pigmentasi/warna koloni.

Cendawan

1.      Mengamati karakteristik mikroskopis morfologi koloni ceendawan meliputi warna, permukaan, bentuk, dan diameter pertumbuhan koloni

2.      Pengamatan mikroskopis morfologi dilakukan pada preparat isolat pada media  WA

a.       Menuang sedikit media WA ke dalam cawan petri untuk mendapatkan lapisan media yang tipis kemudian meratakan seluruh permukaan cawan

b.      Mendinginkan media WA dan  memotong media dengan ukuran 1x1 cm menggunakan scapel

c.       Meletakkan media pada kaca objek steril, menumbuhkan miselium isolat pada media WA dan menutupnya dengan kaca objek steril

d.      Menginkubasinya di dalam cawan petri steril pada suhu ruang selama 1 minggu atau hingga isolat cendawan bersporulasi

e.       Mengamati karakteristik mikroskopis cendawan di bawah mikroskop binokuler

BAKTERI PEMACU PERTUBUHAN TANAMAN (PLANT GROWTH PROMOTING RHIZOBACTERIA)

Tujuan

1.      Mengetahui metode isolasi PGPR dan penyeleksianya

2.      Mempelajari teknik aplikasi PGPR pada tanaman

3.      Mengetahui peranan PGPR bagi tanaman

Alat dan Bahan

            Alat yang digunakan adalah shaker, LAF cabinet, jarum ose, tabung reaksi, rak tabung reaksi, lampu bunsen, dan cawan petri. Bahan yang digunakan adalah media NA, JNFB, NB, pikovskaya agar, alexandrov agar, spritus, alkohol 70%, tisu, tusuk bambu steril, kapas, wraping steril.

Cara Kerja

1.      Menyeleksi potensi isolat bakteri hasil isolasi dari rhizosfer dan rhizoplan sebagai pemacu pertumbuhan tnaman melalui uji penambat nitrogen, pelarut fospat dan kalium.

Penambat Nitrogen

a.       Menuangkan 9 ml media ke dalam tabung reaksi dan menyumbat mulut tabung reaksi menggunakan kapas dan mensterilisasi media

b.      Mensuspensi koloni sel isolat bakteri yang berumur 48 jam pada air steril

c.       Menumbuhkan 1ml suspensi dengan kerapatan  pada 9 ml media semi padat JNFB

d.      Meninkubasinya selama 1 minggu

Penambat nitrogen dicirikan dengan perubahan warna media dari kuning kehijauan menjadi biru dan terdapat lapisan lendir atau pellicle pada permukaan media.

Pelarut Fospat

a.       Menuang media steril dalam cawan petri steril dan mendinginkannya

b.      Mengambil koloni sel isolat bakteri yang berumur 48 jam menggunakan ujung tusuk bambu steril dan menumbuhkannya pada media pikovskaya

c.       Menginkubasi selama 1 minggu

Bakteri yang melarutkan fospat dicirikan dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni bakteri.

Pelarut Kalium

a.       Menuang media steril dalam cawan petri steril dan mendinginkannya

b.      Mengambil koloni sel isolat bakteri yang berumur 48 jam menggunakan ujung tusuk bambu steril dan menumbuhkannya pada media alexandrov

c.       Menginkubasi selama 1 minggu

Bakteri yang melarutkan kalium dicirikan dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni bakteri.

2.      Memperbanyak isolat bakteri yang terpilih pada media cair NB.